Atelier scientifique

(actualisé le ) par Pierre Vaquer


L’atelier scientifique : « Génétique du Peuplier Noir »
Année 2015-2016

Lycée Cormontaigne Metz

1. OBJECTIFS DE L’ATELIER
Des élèves volontaires de 1èreS1 se sont inscrits à l’atelier scientifique et ont travaillé 2H presque tous les vendredis à partir de mi-janvier jusqu’à mi-juin 2016 sur la génétique du peuplier noir.
C’est un travail scientifique de recherche mené avec l’INRA ( Institut National de recherche Agronomique) sur ce végétal qui est en voie de disparition en France car son milieu naturel constitué par les berges de rivières sableuses disparaît progressivement avec l’aménagement des voies de navigation.
Sa survie est liée à son degré d’adaptation aux conditions d’environnement changeantes et cela est possible grâce à la variété génétique au sein de cette espèce.
Notre problématique générale était de montrer le polymorphisme des gènes du peuplier noir c’est-à-dire que pour un gène donné il existe de nombreux allèles.
Pour cela on a mené deux types d’étude :

-  1ère étude : Des mesures sur les feuilles et racines pour essayer de mettre en évidence une différence de croissance entre des variétés génétiques du peuplier noir en calculant un indice de croissance le rapport hauteur/largeur des feuilles.

-  2ème étude : L’analyse de leur ADN pour mettre en évidence d’éventuelles mutations notamment sur 3gènes choisis :

o Le gène PHYB1et le gène PHYA : 2 gènes impliqués dans la fabrication de pigments appelés phytochromes, nécessaires à la photosynthèse,
o Le gène CAD impliqué dans la floraison.

2. Réception de 20 BOUTURES de peupliers noirs  :

Mise en culture de 20 boutures de peuplier noir de 4 souches génétiques différentes reçues de l’INRA d’Orléans en janvier 2016 avec mise en cultures dans des récipients remplis d’eau ( 4 semaines)

ORIGINE :
o 5 Boutures souche génétique MOS 06 ( 5 individus : A, B, C , D et E)

o 5 Boutures souche génétique MOS 12 ( 5 individus : A, B, C , D et E)

o 5 Boutures souche génétique MOS 18 ( 5 individus : A, B, C , D et E)

o 5 Boutures souche génétique MOS 22 ( 5 individus : A, B, C , D et E)


Bouture MOS 18 feuillée
13/05/2016

3. Mise sur terreau des 20 BOUTURES de peupliers noirs

Nettoyage des pots de cultures par Bastien

Transfert sur terreau par Timothée

4. Etude biométrique des feuilles
a. Problématique : Y-a-t-il un moyen de différencier les souches génétiques différentes de peuplier noir ?

b. Hypothèse : On suppose que la croissance des feuilles est différente en fonction des variétés génétiques de peuplier. Cela pourrait traduire l’existence de gènes mutés qui expliqueraient cette différence de croissance.
Si on montre qu’entre nos 4 variétés il existe une croissance différente des feuilles, alors notre hypothèse sera vérifiée.

c. Expériences : On se propose de mesurer la longueur et la largeur de chaque feuille de peuplier noir.
C’est un moyen d’apprécier la croissance des feuilles. On réalisera plusieurs séries de mesures au cours du temps.

Pour faciliter la comparaison, on calcule le rapport largeur/longueur ( L/H) de chaque feuille.

d- Réalisation de mesures de croissance (feuilles et racines).

-  Fabrication d’un tableau de données et calcul des indices longueur/largeur feuille. Analyse et interprétation des données.
-  Apprentissage technique : maîtrise de l’utilisation du tableur excel.


e. Exploitation des données
On constate pour le peuplier noir MOS 06 que la moyenne du rapport L/H varie très peu entre 2 mesures espacées de plus d’un mois : 0.77 le 17/03/2016 et 0.76 le 28/04/2016.
Par contre pour la souche MOS 22 il y une variation de 0.06 ( entre 0.84 et 0.90).
Quand on compare les moyenne de croissance entre les 2 souches MOS 06 et MOS 22 on observe une différence de 0.10 puisque que l’on trouve 0.77 pour MOS 06 et 0.87 pour MOS 22.
On peut donc penser qu’il y a effectivement une différence de croissance entre ces 2 souches de peuplier noir qui se caractérise par un rapport L/H légèrement différent qui ne se remarque pas à l’œil nu.
Il faudrait corroborer ces faits avec les mesures de MOS 12 et MOS 18 non encore fournis par les groupes de travail en charge de ce travail.

f. Difficultés rencontrées
Surtout au niveau de la culture des boutures et du taux de survie quand il y a eu le transfert sur terreau.
Au 03/06/2017 : 10 boutures/ 20 sont survivantes soit un taux de survie de 50%.

Renseignement pris auprès de l’iNRA il ya souvent des pertes lors du changement de milieu.
Par ailleurs nous avons au départ mis trop d’eau.
Il y a eu aussi du fait des week-ends au lycée un effet de serre non contrôlé par l’absence de personnels : trop d’ensoleillement et pas assez d’arrosage.
Il faudra mieux prévoir ces aspects l’année prochaine.

5. EXTRACTION de l’ADN des feuilles de peuplier noir

1. Problématique : Y-a-t-il un moyen de différencier les souches génétiques différentes de peuplier noir ?
2. Hypothèse : On suppose que pour un gène donné il doit y avoir des versions mutées ou allèles responsables de l’existence des différentes variétés de peuplier.
Si on montre qu’entre nos 4 variétés il existe une mutation pour le gène choisi PHYB1, notre hypothèse sera vérifiée.
3. Expériences : On se propose d’extraire l’ADN de nos 4 variétés de peuplier noir selon le protocole donné par l’école de l’ADN de Nîmes dans le cade de l’opération « Génome à l’école » dans lequel nous sommes inscrits.
Ce protocole a été modifié et adapté par le lycée Jean Moulin de Pézenas.

Etape 1 : Extractions de l’ADN des feuilles de peuplier des 4 souches

-  Les 1ères séances ont nécessité 2 H de travail : prendre le temps bien lire les instructions et d’apprendre les gestes techniques.
-  Par la suite elles ont été réalisées en 1H40. Il faut environ une cinquantaine d’échantillons d’ADN avant de faire un envoi groupé au génoscope pour séquençage.
-  Par conséquent il a fallu répéter cette séance un certain nombre de fois d’autant plus que les 1ères séances n’ont pas été fructueuses suite à diverses erreurs de manipulations (erreur de pipetage, perte de traçabilité car des tubes non annotés, manque de masse de matière végétale au départ, inversion d’étapes…).
5. Exemples d’apprentissages techniques multiples de gestes techniques et de l’utilisation de matériel de laboratoire comme  : l’utilisation du vortex, , de colonnes de migration, …

Etape 2 : Repérage du gène d’intérêt grâce à des sondes d’ADN appelées amorces
Une fois un certain nombre d’échantillons d’ADN brut extrait des feuilles de peuplier noir réalisés on isole le gène que l’on désire étudier.
Pour cela, on dispose d’un coupe d’amorces (Forward et Reverse) pour ce gène, ici PHYB1 ( phytochrome B1  rôle dans la photomorphogénèse).
Une fois ces gènes reconnus on les amplifie en de nombreux exemplaires grâce à l’enzyme polymérase green taq.
Tous les microtubes constitués ont été mis dans le thermocycleur (obtenu grâce au programme génome à l’école) programmé avec différentes phases de températures ( 94°C pour la plus élevée, 12°C pour la plus faible) pendant des laps de temps spécifiques pour une durée totale de 1h40.
A l’issue, on obtient des mélanges dits « PCR » (polymerisation chain reaction) c’est-à-dire des tubes contenant des fragments d’ADN correspondant gène amplifié.

Etape 3 : Séquençage par le génoscope d’EVRY

L’envoi de nos gènes isolés et amplifiés au génoscope Paris est prévu mi-juin pour qu’il effectue le séquençage. Il nous enverra début juillet ou alors début septembre un fichier informatique avec les résultats bruts.
4. Exploitation des résultats
 en 2016-2017
Conclusion
Les élèves assidus se sont très bien investis en venant même en dehors des séances pour surveiller la croissance des boutures et assurer l’entretien par l’arrosage notamment voire poursuivre les mesures.
Le travail des mesures a été long et fastidieux mais cela n’a pas découragé les élèves, ils se sont montrés appliqués et persévérants.
Nous ne sommes pas parvenus au bout du programme établi puisqu’en fin d’année scolaire il nous manque les résultats du séquençage et son exploitation mais le travail réalisé est déjà intéressant.
La partie manquante pourra être intégrée dans la 2ème année.
Elle nécessitera l’aide de notre référent scientifique que nous avons peu sollicité cette année car il n’y avait pas de difficultés techniques ou notionnelles rencontrées.
Son aide se fera au niveau de l’outil d’exploitation des séquences de nucléotides grâce un logiciel spécifique peut-être plus facile que le nôtre « Génalys » pas facile à comprendre et à utiliser.
Le but final sera de comparer certaines séquences de gènes et repérer des zones de mutation permettant de mesurer effectivement le polymorphisme génique au sein des 4 variétés génétiques de peuplier noir cultivées.
Espérons que de nombreux élèves poursuivront cette aventure scientifique à la rentrée de septembre 2016 en s’inscrivant à cet atelier ….
…… à suivre ……
JC Rocq-Laborantines SVT